Inhalacja wodoru – redukcja stresu oksydacyjnego – Tło badania

Uważa się, że wodór cząsteczkowy ma hamujący wpływ na stres oksydacyjny, osłabiając w ten sposób początek i postęp różnych chorób, w tym chorób układu krążenia; Jednak w nielicznych doniesieniach oceniano zapobiegawczy wpływ konstytutywnej inhalacji wodoru na przebudowę naczyń. W tym przypadku badaliśmy wpływ konstytutywnej inhalacji gazowego wodoru na tworzenie neointimy naczyniowej przy użyciu mysiego modelu uszkodzenia naczyń wywołanego mankietem. Po konstytutywnej inhalacji sprężonego wodoru (O2 21%, N2 77,7%, wodór 1,3%) lub samego sprężonego powietrza (O 2 21%, N 279%) przez myszy C57BL / 6 przez 2 tygodnie od 8 tygodnia życia w zamkniętej komorze, zapalny uraz mankietu wywołano założeniem mankietu polietylenowego wokół tętnicy udowej w znieczuleniu, a podawanie wodoru kontynuowano do momentu pobrania próbki z tętnicy udowej.

Tworzenie neointimy, któremu towarzyszył wzrost proliferacji komórek, było znacznie osłabione w grupie wodorowej w porównaniu z grupą kontrolną. Obniżenie poziomu oksydazy NADPH NOX1 w odpowiedzi na uszkodzenie mankietu wykazano w grupie wodorowej, ale poziomy ekspresji podjednostek oksydazy NADPH, p40phox i p47phox, nie różniły się istotnie między grupą wodoru i grupą kontrolną. Chociaż wzrost produkcji anionów ponadtlenkowych nie różnił się istotnie między grupą wodoru i grupą kontrolną, ) w grupie wodorowej. Wyniki te pokazują, że konstytutywne wdychanie gazowego wodoru osłabia przebudowę naczyń częściowo poprzez redukcję stresu oksydacyjnego, co sugeruje, że konstytutywna inhalacja gazowego wodoru w bezpiecznym stężeniu w środowisku życia może być skuteczną strategią zapobiegania chorobom naczyniowym, takim jak miażdżyca tętnic.

Inhalacja wodoru -Wprowadzenie

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD), w tym choroba niedokrwienna serca, pozostają główną przyczyną utraty zdrowia i zgonów na całym świecie [ 1 ]. Sugerowano, że choroby związane ze stylem życia, takie jak nadciśnienie, cukrzyca i otyłość, biorą udział w początkach CVD, a progresji choroby towarzyszy uszkodzenie naczyń spowodowane przez przewlekły / uporczywy stres oksydacyjny zależny od reaktywnych form tlenu (RFT) [ 2 , 3 ]. Stres oksydacyjny odnosi się do podwyższonych poziomów wewnątrzkomórkowych RFT, które powodują uszkodzenie lipidów, białek i DNA [ 4]. Dlatego redukcja stresu oksydacyjnego poprzez zmniejszenie ROS może być podejściem do zapobiegania wystąpieniu CVD. Rzeczywiście, stwierdzono, że blokery receptora angiotensyny II osłabiają miażdżycę w wyniku regulacji w dół ROS poprzez hamowanie aktywności oksydazy fosforanu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH) [ 5 ].

Doniesiono, że wodór cząsteczkowy osłabia stres oksydacyjny działając jako zmiatacz rodników dla rodników hydroksylowych (⋅OH) i nadtlenoazotynu (ONOO-) in vitro [ 6 ]. Od tego czasu, wodór cząsteczkowy Udowodniono spowodować korzystne efekty w patofizjologii wielu chorób poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego [ 7 – 10 ]. Istnieje kilka wygodnych i skutecznych systemów dostarczania, takich jak inhalacja, doustne przyjmowanie wody bogatej w wodór, wstrzykiwanie soli fizjologicznej bogatej w wodór i bezpośrednie wprowadzanie (kąpiel, krople do oczu itp.) Do podawania wodoru cząsteczkowego in vivo [ 11]. Sugerowano, że zapobiega wodoru cząsteczkowego naczyniowych przebudowy w modelach zwierzęcych, takich jak niedokrwienie i reperfuzję (l / R), uszkodzenia przeszczepów żyły szyjnej kateteru, skurcz naczyń mózgowych i krwotoku podpajęczynówkowego poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego [ 12 – 15 ].

W poprzednich doniesieniach stwierdzono, że wdychanie 2% wodoru w czasie 2-godzinnego stanu niedokrwiennego przed reperfuzją jest skuteczne w łagodzeniu śmiertelności i wyników czynnościowych w modelu urazu I / R szczura [ 12]. Jednak niewiele wiadomo na temat korzystnego wpływu konstytutywnej inhalacji gazowego wodoru na profilaktykę CVD w życiu codziennym. Ostatnio wodór, który można łatwo wytworzyć z wody poprzez elektrolizę, nie tylko zyskał uznanie jako źródło energii, ale oczekuje się również, że przyczyni się do zdrowego stylu życia. Dlatego zbadaliśmy wpływ konstytutywnego podawania wodoru w niskim stężeniu na przebudowę naczyń przy użyciu modelu uszkodzenia naczyń wywołanego mankietem. W tym badaniu skupiliśmy się na wpływie inhalacji wodoru na CVD jako interwencji dotyczącej stylu życia. CVD jest wywoływane przez chorobę związaną ze stylem życia z przewlekłym / uporczywym stresem oksydacyjnym; to jest,

Materiały i metody

Zwierzęta i leczenie

Myszy C57BL / 6 zakupiono od CLEA Japan, Inc. (Tokio, Japonia). We wszystkich doświadczeniach stosowano myszy płci męskiej w wieku 8 tygodni (mediana masy ciała 23 g). Osiem zwierząt umieszczono w zamkniętych komorach o wymiarach 350 mm x 150 mm x 150 mm, jak pokazano na ryc.1 . Myszy losowo przypisywano do wodoru lub grupy kontrolnej. Gazowy sprężony wodór (O 2 21%, N 2 77,7%, wodór 1,3%) lub sprężone powietrze (O 2 21%, N 279%) płynął w sposób ciągły z prędkością 0,4 l / min. Wilgotność (do 70%) i temperaturę (około 25 ° C) w zamkniętej komorze monitorowano i utrzymywano za pomocą osuszaczy i dezodorantów. Ściółka dla zwierząt była zmieniana co dwa dni. Pokoje utrzymywano w stałej temperaturze 25 ° C, z automatycznie kontrolowanym cyklem światło-ciemność 12:12 h z włączonym światłem o 7:00 rano. Pożywienie i woda były dostarczane ad libitum.

Miniaturka

Rys. 1. Zamknięta komora używana w naszych eksperymentach.

(a) wlot gazu, (b) wylot gazu, (c) regulator przepływu gazu, (d) pojemnik na przynęty, oraz (e) wlot wody zasilającej.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.g001

Po inhalacji 1,3% gazowego wodoru, w ciągu 2 tygodni od wieku 8 tygodni, zapalne uszkodzenie mankietu wywołano polietylen umieszczania mankietu wokół tętnicy udowej w znieczuleniu, jak to opisano wcześniej [ 16 – 18 ]. Wszystkie myszy przeszły operację umieszczenia mankietu w ciągu godziny po podaniu 0,1 ml / 10 g złożonego środka znieczulającego (0,3 mg / kg medetomidyny, 4,0 mg / kg midazolamu, 5,0 mg / kg butorfanolu) w soli fizjologicznej przez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Aby pobrać próbkę z tętnicy udowej w każdym eksperymencie, wypuszczano krew przez perfuzję przez serce z PBS do eutanazji w znieczuleniu, jak opisano powyżej. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono w naszym laboratorium między 9:00 a 18:00.

Protokoły eksperymentalne były zgodne z wytycznymi Komisji Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Ehime i zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję Badań nad Zwierzętami.

Analiza morfometryczna

W analizie morfometrycznej tętnice udowe, w których założono mankiet przez 14 dni z inhalacją 1,3% gazowego wodoru, pobrano po perfuzji 4% paraformaldehydem (PFA) i przepłukano przez 24 godziny 4% PFA w temperaturze 4 ° C. Kolejne 4-μm skrawki zatopione w parafinie wybarwiono Elastica van Gieson (EVG) w celu obserwacji tworzenia się neointimy. Skrawki obserwowano pod mikroskopem świetlnym BZ9000 (Keyence, Osaka, Japonia), a obszar neointimy mierzono za pomocą oprogramowania ImageJ.

Barwienie immunohistochemiczne

Do badań immunohistochemicznych wykorzystano również próbki zatopione w parafinie do analizy morfometrycznej. Skrawki traktowano 3% H 2 O 2, przez 10 min w celu zablokowania endogennej peroksydazy i odsłanianie antygenu przeprowadzano obróbkę cieplną w roztworze buforowym cytrynianu (pH 6.0). Skrawki inkubowano przez noc w 4 ° C z przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem z proliferującym jądrowym antygenem komórek (PCNA) (Abcam, Ltd., Newcastle upon Tyne, Wielka Brytania). Wiązanie przeciwciał wizualizowano za pomocą 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) przy użyciu zestawu do barwienia myszy, Histofine (Nichirei Bioscience, Tokio, Japonia). Wyniki barwienia oceniano przez zliczenie liczby komórek PCNA-dodatnich w neointimie.

Mikrodysekcja laserowa

Pobrano tętnice udowe, w których założono mankiet przez 7 dni przy wdychaniu 1,3% gazowego wodoru i przygotowano nieutrwalone, zamrożone skrawki na szkiełkach pokrytych folią (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy). Skrawki utrwalono etanolem zawierającym 5% kwas octowy i wybarwiono błękitem toluidynowym. Tkanki neointimy i pożywki tętniczej pobrano z tkanek tętnicy udowej metodą mikrodysekcji laserowej przy użyciu aparatu LMD7000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy). Każdą próbkę zebrano w probówce 0,2 ml.

RT-PCR

Wykorzystano próbki pobrane metodą mikrodysekcji laserowej lub zbiorcze próbki 8–10 tętnic w grupie bez mankietu oraz 4–6 tętnic w grupie 7 dni po założeniu mankietu. Całkowity RNA ekstrahowano z tętnic udowych przy użyciu Sepasol RNA I Super G (Nacalai Tesque, Kyoto, Japonia). Ekspresję mRNA oceniano ilościowo za pomocą SYBR Premix Ex Taq stosując Thermal Cycler Dice Realtime System (Takara Bio, Shiga, Japonia). Sekwencje starterów PCR podano w tabeli S1 .

Pomiar reaktywnych gatunków tlenu (RFT)

Pobrano tętnice udowe, w których założono mankiet przez 7 dni przy wdychaniu 1,3% gazowego wodoru i przygotowano seryjne 6-μm niezamrożone skrawki. W celu wykrycia anionów ponadtlenkowych (O  ⋅) dodano 10 µmol / l fluorogennego dihydroetydyny (DHE) (Abcam, Ltd., Newcastle upon Tyne, Wielka Brytania) i skrawki inkubowano przez 30 min w 37 ° C. Metoda została opisana wcześniej [ 16 , 17 ]. W celu wykrycia rodników hydroksylowych (⋅OH) i nadtlenoazotynu (ONOO  ) dodano 10 μmol / l hydroksyfenylofluoresceiny (HPF) (GORYO Chemical, Inc., Sapporo, Japonia) i skrawki inkubowano przez 30 minut w 37 ° C. Metoda barwienia HPF została opisana wcześniej [ 19]. Wyniki uzyskano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego BZ9000 (Keyence, Osaka, Japonia). Intensywność fluorescencji w naczyniach neointimy i ośrodkach tętniczych analizowano i oznaczano ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.

Analiza uszkodzeń DNA

Zamrożone próbki do pomiaru ROS wykorzystano do analizy uszkodzeń DNA metodą detekcji 8-nitroguaniny i 8-hydroksy-2′-deoksyguanozyny (8-OHdG). Przygotowano seryjne 6 µm nie utrwalone zamrożone skrawki. Niektóre skrawki utrwalano przez 5 minut etanolem. Skrawki inkubowano przez noc w temperaturze 4 ° C z pierwszorzędowym przeciwciałem poliklonalnym króliczej anty-8-nitroguanozyny (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japonia) lub pierwszorzędowym przeciwciałem poliklonalnym królika przeciwko 8-OHdG (Bioss Antibodies Inc., Woburn, MA ), a następnie drugorzędowe przeciwciało przeciw królikowi (Thermo Fisher Scientific KK, Waltham, MA). Wiązanie przeciwciał wizualizowano za pomocą Alexa 594 przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego BZ9000. Intensywność fluorescencji w naczyniach neointimy i ośrodkach tętniczych analizowano i oznaczano ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.

Analiza statystyczna

Wszystkie wartości wyrażono na figurach jako średnie ± SD. Dane oceniano metodą ANOVA. Jeśli stwierdzono statystycznie istotny efekt, przeprowadzono analizę post hoc w celu wykrycia różnicy między grupami. Wartości P <0,05 uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

Hamujący wpływ inhalacji wodoru na powstawanie neointimy

Zbadaliśmy wpływ wodoru na tworzenie się neointimy 14 dni po założeniu mankietu polietylenowego wokół tętnicy udowej. Zaobserwowano powstawanie Neointimy w grupach wodoru i powietrza. Stosunek powierzchni neointimy do powierzchni ośrodków naczyniowych w grupie wodorowej (Hyd) był znacząco osłabiony 0,55-krotnie w porównaniu z grupą kontrolną z powietrzem (Con) ( Ryc. 2 ).

Miniaturka

Ryc. 2. Wpływ inhalacji wodoru na tworzenie się neointimy w uszkodzonej tętnicy udowej po założeniu mankietu.

Po inhalacji gazowego wodoru przez 2 tygodnie od 8 tygodnia życia u myszy C57BL / 6 wywołano uszkodzenie mankietu przez założenie mankietu polietylenowego wokół tętnicy udowej. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia i analizę ilościową obszaru neointimy w przekrojach poprzecznych tętnicy udowej z barwieniem elastycznym van Giesona (EVG). Oryginalne powiększenie x 200 (słupek skali: 100 μm) i x 600 (słupek skali: 30 μm). W analizie ilościowej dane przedstawiają stosunek powierzchni tworzenia się neointimy do powierzchni ośrodków naczyniowych, a wartości to średnia ± SEM (n = 16 dla grupy kontrolnej (Con), n = 24 dla grupy wodorowej (Hyd)). * p <0,05 vs. Con.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.g002

Hamujący wpływ inhalacji wodoru na proliferację komórek

Zaobserwowaliśmy, że wodór zmniejszył obszar neointimy, ze spadkiem wskaźnika znakowania PCNA w błonie wewnętrznej. Komórki PCNA-dodatnie w neointimie obserwowano zarówno w grupie wodoru, jak i powietrza. Wskaźnik znakowania PCNA w neointimie w Hydr był zmniejszony 0,69-krotnie w porównaniu z indeksem Con ( ryc. 3 ). Ponadto większość komórek, które namnażały się w błonie wewnętrznej po założeniu mankietu, było dodatnich pod względem α-SMA ( ryc . S1 ).

Miniaturka

Ryc. 3. Wpływ inhalacji wodoru na proliferację komórek w uszkodzonej tętnicy udowej po założeniu mankietu.

Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia i analizę ilościową uszkodzonej tętnicy udowej w przekrojach po barwieniu immunohistochemicznym (dla PCNA). Oryginalne powiększenie x 200 (słupek skali: 100 μm) i x 600 (słupek skali: 30 μm). W analizie ilościowej dane przedstawiają liczbę komórek PCNA-dodatnich w neointimy i pożywce naczyniowej, a wartości są średnią ± SEM (n = 16 dla każdej grupy). * p <0,05 vs. Con.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.g003

Hamujący wpływ inhalacji wodoru na ekspresję podjednostek oksydazy NADPH

Oceniliśmy wpływ wodoru na poziom mRNA podjednostek NOX1 (rodzaj oksydazy NADPH) i NOX1 (p40phox, p47phox) w naczyniach neointimy i środkach tętniczych tętnicy udowej 7 dni po założeniu mankietu. Poziom ekspresji NOX1 był znacząco obniżony w Hyd, ale poziomy ekspresji p40phox i p47phox nie różniły się istotnie między Con i Hyd. Poziom ekspresji NOX1 w Hyd był 0,23-krotnie w porównaniu z poziomem w Con ( Ryc. 4 ).

Miniaturka

Rys. 4. Wpływ wdychania gazowego wodoru na podjednostki oksydazy NADPH i oksydazy NADPH.

Ekspresja NOX1 (a), p40phox (b) i p47phox (c) określona przez ilościowy RT-PCR w czasie rzeczywistym w tętnicy udowej 7 dni po założeniu mankietu. Próbki tkanek przygotowano z tętnic z mankietem 7 dni po operacji. Wartości to średnie ± SEM (n = 5 dla każdej grupy). Kon; grupa kontrolna, Hyd; grupa wodorowa.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.g004

Hamujący wpływ wdychania wodoru na produkcję RFT

Zbadaliśmy wpływ wodoru na wytwarzanie RFT, takich jak anion ponadtlenkowy, rodniki hydroksylowe i nadtlenoazotyn w naczyniach neointimy i środkach tętniczych tętnicy udowej 7 dni po założeniu mankietu. Wytwarzanie anionu ponadtlenkowego oceniano przez barwienie DHE, a wytwarzanie rodników hydroksylowych i nadtlenoazotynu oceniano za pomocą barwienia HPF. Nie było znaczącej różnicy w wytwarzaniu anionu ponadtlenkowego między Con i Hyd Rys. 5A ). Z drugiej strony rodniki hydroksylowe i nadtlenoazotyn były znacznie osłabione 0,84-krotnie w Hydrze w porównaniu z tymi w Con ( Ryc. 5B ).

Miniaturka

Rys. 5. Wpływ wdychania wodoru na produkcję ROS.

Próbki tkanek przygotowano z tętnic z mankietem 7 dni po operacji. (A) Reprezentatywne zdjęcia przekrojów poprzecznych uszkodzonej tętnicy udowej po wybarwieniu DHE i intensywności fluorescencji w błonie wewnętrznej i pożywce. (B) Reprezentatywne zdjęcia przekrojów poprzecznych uszkodzonej tętnicy udowej po barwieniu HPF i intensywności fluorescencji w błonie wewnętrznej i środkowej. Oryginalne zdjęcia uzyskano jako obrazy 8-bitowe (oryginalne powiększenie x 200; pasek skali: 100 μm), a dane reprezentują względne jednostki fluorescencji (RFU). Wartości to średnie ± SEM (n = 18 do 21 dla każdej grupy). ** p <0,01 vs. grupa z powietrzem (Con). Hyd; grupa wodorowa.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.g005

Hamujący wpływ wdychania wodoru na uszkodzenie DNA przez RFT

Zbadaliśmy wpływ wodoru na uszkodzenie DNA wywołane przez ROS w naczyniach neointimy i środkach tętniczych uszkodzonej tętnicy 7 dni po założeniu mankietu. Nitroguanozyna jest markerem uszkodzeń DNA przez nadtlenoazotyn (ONOO  ) i nadtlenek wodoru, a 8-OHdG jest również reprezentatywnym markerem uszkodzeń DNA przez rodniki hydroksylowe (⋅OH). Uszkodzenie DNA wywołane przez ROS określono przez barwienie immunocytochemiczne. Wskaźnik znakowania fluorescencji 8-nitroguanozyny był znacznie zmniejszony 0,93-krotnie w Hydrze w porównaniu z tym w Con ( Fig. 6A ). Wskaźnik znakowania fluorescencji 8-OHdG był również znacznie zmniejszony 0,84-krotnie w Hyd w porównaniu z tym w Con ( Ryc. 6B ).

Miniaturka

Rys. 6. Wpływ wodoru na uszkodzenie DNA przez RFT.

Inhalacja wodoru -Próbki tkanek przygotowano z tętnic z mankietem 7 dni po operacji. (A) Reprezentatywne zdjęcia przekrojów poprzecznych uszkodzonej tętnicy udowej po barwieniu immunohistochemicznym przeciwciałem antynitroguanidyny i intensywności fluorescencji w błonie wewnętrznej i środkowej. Oryginalne zdjęcia uzyskano jako obrazy 8-bitowe (oryginalne powiększenie x 200; pasek skali: 100 μm), a dane reprezentują względne jednostki fluorescencji (RFU). Wartości to średnia ± SEM (n = 21 dla grupy powietrza (Con), n = 21 dla grupy wodorowej (Hyd)). * p <0,05 vs. Con.

 

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.g006

Dyskusja

Wyniki te pokazały, że konstytutywna inhalacja wodoru o niskim stężeniu osłabiła przebudowę naczyń poprzez redukcję stresu oksydacyjnego i sygnalizację proliferacyjną. Wcześniejsze doniesienia o wpływie inhalacji gazowego wodoru na CVD koncentrowały się na zastosowaniu klinicznym z wykorzystaniem szczurzego modelu urazu I / R [ 12 , 20 ]. Z drugiej strony, badanie wpływu inhalacji wodoru na CVD koncentrowało się na zmianie stylu życia. W niniejszym badaniu, biorąc pod uwagę codzienne życie ludzi, profilaktyczny wpływ konstytutywnego podawania gazowego wodoru na przebudowę naczyń badano na modelu uszkodzenia mankietu myszy.

W tym modelu uszkodzenia naczyń wiadomo, że ponadtlenek będący wynikiem zwiększonej aktywności oksydazy NADPH sprzyja proliferacji VSMC i tworzeniu neointimy [ 21 ]. Podjednostki oksydazy NADPH (p40phox i p47phox) są również znane z promowania przebudowy naczyń, w tym miażdżycy tętnic, jako silnych regulatorów dodatnich [ 22 , 23 ]. Zhang i in. wykazali, że dootrzewnowe wstrzyknięcie pożywki bogatej w wodór spowodowało zmniejszenie ekspresji oksydazy NADPH u szczurów modelowych z przerostem mięśnia sercowego indukowanym izoproterenolem (ISO) [ 24 ]. Qin i in. podali, że wstrzyknięcie bogatej w wodór soli fizjologicznej zmniejszyło ponadtlenek i zapobiegło proliferacji i migracji VSMC w modelu uszkodzenia balonu tętnicy szyjnej u szczurów [ 13]. Raporty te sugerują, że wodór cząsteczkowy może zapobiegać CVD poprzez regulację w dół aktywności NADPH i produkcji ponadtlenków.

Jednak wodór cząsteczkowy nie działa jako zmiatacz rodników dla innych RFT, takich jak ponadtlenek, nadtlenek wodoru itp. In vitro [ 6]. Jest to niejasne zagadnienie dotyczące mechanizmu wpływu wodoru cząsteczkowego na aktywność biologiczną. W obecnych wynikach inhalacja gazowego wodoru obniżyła ekspresję oksydazy NADPH, NOX1, ale nie wpłynęła na poziom ekspresji podjednostek oksydazy NADPH, takich jak p40phox i p47phox, w tętnicy udowej 7 dni po założeniu mankietu. Ponadto nie było znaczącej różnicy w produkcji nadtlenków między grupą wodoru a grupą kontrolną. Wyniki te sugerują, że nasz system podawania wodoru może mieć niewielki wpływ na produkcję ponadtlenków poprzez aktywność oksydazy NADPH, ponieważ nie było znaczących zmian w poziomach ekspresji podjednostek oksydazy NADPH. Z drugiej strony, nasze wyniki były zgodne z faktem, że wodór cząsteczkowy nie działa bezpośrednio jako zmiatacz rodników w stosunku do ponadtlenku [6 ].

Generowanie ponadtlenków jest pierwszym krokiem na drodze do generowania różnych RFT, takich jak nadtlenek wodoru, rodniki hydroksylowe (⋅OH) i nadtlenoazotyn (ONOO  ) [ 21 , 22 ]. Na stres oksydacyjny w CVD wpływa nie tylko nadtlenek, ale także ⋅OH i ONOO  , które mają wysoką reaktywność oksydacyjną [ 3 , 25 ]. Wodór cząsteczkowy łagodzi stres oksydacyjny działając jako zmiatacz rodników ⋅OH i ONOO  in vitro [ 6 ]. Ponadto, niektóre badania sugerują, że wodór molekularny jest hamujący wpływ na stres oksydacyjny choroby pośredniczone przez zmniejszenie ⋅OH i ONOO  poziomów in vivo [ 26 ,27 ]. Igarashi i in. podali, że wodór zapobiega uszkodzeniom śródbłonka rogówki podczas operacji zaćmy metodą fakoemulsyfikacji poprzez redukcję ⋅OH [ 27 ]. Zhang i in. donoszą, że picie wody bogatej w wodór znacząco hamowało tworzenie ONOO  na podstawie wykrycia 3-nitrotyrozyny w tętnicach brzusznych powyżej i blisko miejsca koarktacji w modelu koarktacji aorty brzusznej szczura [ 26 ]. Z drugiej strony wskazano również, że do obniżenia poziomu ⋅OH potrzebna jest wystarczająca ilość wodoru [ 8 ]. W naszym eksperymencie stwierdzono wyraźną różnicę w tłumieniu ⋅OH lub, alternatywnie, ONOO poziom w tętnicy udowej 7 dni po założeniu mankietu między grupą wodoru a grupą kontrolną. Dlatego wyniki sugerują, że nasz system podawania wodoru może przyczynić się do częściowego złagodzenia stresu oksydacyjnego zależnego od RFT.

Uszkodzenia DNA wywołane przez ROS i późniejsze ścieżki naprawcze są obecnie coraz bardziej doceniane jako czynnik ryzyka postępu choroby w CVD, w tym miażdżycy [ 28 ]. Szczególnie na uszkodzenia DNA wywołane przez ROS silnie wpływają ⋅OH i ONOO – z powodu silnego utleniania. Powszechnie wiadomo, że 8-hydroksydeoksyguanozyna (8-OHdG) jest reprezentatywnym markerem uszkodzeń DNA wywołanych przez ROS [ 29 , 30 ], a 8-nitroguanozyna jest również ceniona jako marker uszkodzeń DNA przez ROS, takich jak ONOO  [ 31 , 32]. W naszym eksperymencie zarówno poziomy wykrywalności 8-OHdG, jak i 8-nitroguanozyny spadły w tętnicy udowej 7 dni po założeniu mankietu w grupie wodorowej. Wyniki te sugerują, że nasz system podawania wodoru umożliwia złagodzenie uszkodzeń DNA poprzez regulację w dół poziomów ⋅OH i ONOO  .

W zdarzeniach przebudowy naczyń ROS aktywują proliferację i migrację VSMC poprzez szlak transdukcji sygnału kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), w tym kinazę regulowaną sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK), p38 MAPK i kinazę końcową c-Jun NH2 (JNK) [ 33 ]. Ponadto sygnalizacja MAPK bierze udział w produkcji cytokin zapalnych, a stan zapalny przyspiesza przebudowę naczyń [ 34 , 35 ]. Stwierdzono również, że sygnały MAPK i stan zapalny są wzmacniane przez założenie mankietu w naszym modelu uszkodzenia naczyń [ 18 ]. Niektóre doniesienia wskazują, że wodór cząsteczkowy reguluje również szlak transdukcji sygnału MAPK i stan zapalny [ 9 , 36]. Cardinal i in. donieśli, że picie wody bogatej w wodór miało hamujący wpływ na fosforylację ERK, p38 i JNK w modelu przewlekłej nefropatii alloprzeszczepu [ 36 ]; jednakże barwienie immunochemiczne przeciwciałem fosforylowanym-ERK nie wykazało żadnej różnicy w każdej grupie w tym badaniu ( rys . S2 ). Niezależnie od drogi podania wodór cząsteczkowy działa przeciwzapalnie poprzez hamowanie produkcji cytokin zapalnych związanych z przebudową naczyń, takich jak TNF-α i IL-1β [ 9 ]. Jednak nie było znaczącej różnicy w hamującym wpływie wodoru na poziom ekspresji F4 / 80 przy użyciu barwienia immunohistochemicznego w naszych doświadczeniach ( S3 ryc.). Dlatego trudno stwierdzić, że wpływ naszego systemu podawania wodoru na przebudowę naczyń był wynikiem wpływu na cytokiny zapalne. Konieczne są dalsze badania w celu wyjaśnienia szczegółowego mechanizmu.

Z drugiej strony w badaniu postawiono kilka pytań. Wdychanie jako sposób podawania w życiu codziennym ma najprawdopodobniej zdolność do podawania konstytutywnego w porównaniu z piciem lub zastrzykiem itp. Chociaż nasze badanie wykazało, że konstytutywne podawanie wodoru w niskim stężeniu częściowo osłabiło przebudowę naczyń poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego, nie wiadomo, czy przerywane podawanie przez ten system podawania wodoru jest skuteczne w zapobieganiu przebudowie naczyń. Rzeczywiście, trudno jest konstytutywnie wdychać wodór w codziennym życiu, ponieważ pacjenci nie są stale w domu. Ponadto konieczne jest również zbadanie, czy istnieje hamujący wpływ systemu podawania wodoru w modelu choroby związanej ze stylem życia (np. KKAy jako myszy modelowe dla cukrzycy), ponieważ ryzyko CVD jest zwiększone przez połączenie chorób związanych ze stylem życia. Dlatego konieczne jest dalsze badanie.

Podsumowując, nasze odkrycia potwierdzają pogląd, że długotrwałe wdychanie wodoru w bezpiecznym stężeniu ma korzystny wpływ na przebudowę naczyń, przynajmniej ze względu na jego hamujący wpływ na RFT, takie jak ⋅OH i ONOO  , uszkodzenie DNA i proliferację komórek. Ostatnio bezpiecznie używano maszyny do produkcji wodoru i sugeruje się, że konstytutywna inhalacja wodoru zapewnia korzyści mimowolnie w codziennym życiu. Z drugiej strony, picie wody bogatej w wodór ma tymczasowy efekt i pacjent musi chcieć pić wodę bogatą w wodór. Dlatego uważamy, że inhalacja jest bardziej skuteczną i naturalną metodą podawania wodoru. Można się spodziewać, że wdychanie wodoru w środowisku życia może być przydatne w łagodzeniu chorób naczyniowych, takich jak miażdżyca.

Inhalacja wodoru – Dodatkowe informacje

S1 Rys. Komórki mięśni gładkich (komórki α-SMA-dodatnie) w neointimie.

Reprezentatywne zdjęcia przekrojów tętnicy udowej mankietu (-) i mankietu (+) po barwieniu immunohistochemicznym (dla α-SMA). Z tętnicy udowej (+) mankietu pobrano próbki po 14 dniach od założenia mankietu. Skrawki wybarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem antygen α-SMA (SIGMA, MO, USA). Metody zostały opisane tak samo jak powyżej w sekcji Barwienie immunohistochemiczne (PCNA). Oryginalne powiększenie × 200 (pasek skali: 30 μm).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.s003

(TIF)

S2 Rys. Wpływ inhalacji wodoru na ekspresję fosforylowanej ERK w uszkodzonej tętnicy udowej po założeniu mankietu.

Reprezentatywne zdjęcia i analiza ilościowa przekrojów poprzecznych uszkodzonej tętnicy udowej po barwieniu immunohistochemicznym (dla fosforylowanej ERK). Skrawki wybarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem antygen fosforylowany-ERK (Cell Signaling Technology, MO, USA). Metody zostały opisane tak samo jak powyżej w sekcji Barwienie immunohistochemiczne (PCNA). Oryginalne powiększenie × 200 (pasek skali: 30 μm). Oryginalne powiększenie × 600 (pasek skali: 20 μm). W analizie ilościowej dane przedstawiają stosunek powierzchni fosforylowanej-ERK-dodatniej w neointimach i ośrodkach naczyniowych, a wartości to średnia ± SEM (n = 16 dla grupy powietrza (Con), n = 15 dla grupy wodorowej (Hyd)). P = 0,48 vs. Con.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.s004

(TIF)

S3 Ryc. Wpływ inhalacji wodoru na ekspresję F4 / 80 w uszkodzonej tętnicy udowej po założeniu mankietu.

Reprezentatywne zdjęcia i analiza ilościowa przekrojów poprzecznych uszkodzonej tętnicy udowej po barwieniu immunohistochemicznym (dla F4 / 80). Skrawki wybarwiono przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem antygen F4 / 80 (BMA Biomedicals, Augst, Szwajcaria). Metody zostały opisane tak samo jak powyżej w sekcji Barwienie immunohistochemiczne (PCNA). Oryginalne powiększenie × 600 (pasek skali: 20 μm). W analizie ilościowej dane przedstawiają stosunek powierzchni F4 / 80-dodatniej w neointimach, a wartości to średnia ± SEM (n = 16 dla grupy powietrza (Con), n = 15 dla grupy wodorowej (Hyd)). P = 0,98 vs. Con.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227582.s005

(TIF)

Podziękowanie

Badanie to było wspierane technicznie przez Zakład Bio-Medycyny Analitycznej i Zakład Badań na Zwierzętach Laboratoryjnych Centrum Wsparcia Zaawansowanych Badań (ADRES) Uniwersytetu Ehime.